In Zusammenarbeit mit unseren Kollegen Matthew Collins aus York und Jennifer Hiller und Tim Wess aus Cardiff haben wir die mineralische Fraktion des Knochens nach Parametern untersucht, die mit dem Erhalt von Biomolekülen korrelieren. Ziel war es, aufwendige DNA-Tests zu umgehen und statt dessen über eine schnelle Methode zu verfügen, die den Erhalt von DNA ausreichend gut vorhersagt. Im folgenden stellen wir die Verfahrensweisen kurz vor:
Kristallinität des Hydroxylapatits
Mit der Fourier-Transform–Infrarot-Spektrometrie (FTIR) kann die chemische Struktur und Zusammensetzung aufgrund von Unterschieden in Absorption und Emission von Infrarotstrahlung unterschiedlicher chemischer Bindungen erfasst werden (Smith 1996). Termine & Posner (1966) haben diese Technik als erste dafür benutzt um die Kristalle des Hydroxylapatits zu untersuchen. Weitere Untersuchungen (z.B. Weiner & Bar-Yosef 1990; Stiner et al. 1995) benutzen die gleiche Vorgehensweise um der Diagenese in archäologischen Skeletten nachzugehen. Hiefür wird der Infrarot Splitting Faktor (IR-SF) ermittelt (Weiner & Bar-Yosef 1990). Der IR-SF beruht auf einem Signal für die Phosphatbindung, das sich durch die asymmetrische Phosphatanordnung im Hydroxylapatitkristall auf 603 cm-1 und 565 cm-1 aufspaltet (Miller et al. 1999, 2001).
Es handelt sich dabei um eine Region im Infrarot-Spektrum, die schon früher herangezogen wurde, um die Kristallinität von Apatit zu bewerten (z. B. Rey et al. 1991). Der Splitting Faktor (SF = [(A565+A605)/A595] (Wright & Schwarcz, 1996) hat in nativem Rinderknochen ungefähr den Wert 2.8. Er steigt, wenn das Knochenmineral stärker kristallisiert und die organische Matrix verloren geht (Hedges, Millard & Pike 1995).
Karbonat/Phosphat-Verhältnis
Die FTIR-Spektrometrie wird ebenfalls für die Berechnung des Karbonat/Phosphat-Verhältnisses verwendet. Das Verhältnis A1415cm-1/A1035cm-1 ergibt den sogenannten C/P Wert, der dem Verhältnis von CO3 zu PO4 entspricht (Wright & Schwarcz 1996). Rezenter Knochen enthält 3-5 % Karbonat, das direkt in das Apatitkristall (an Stelle von OH oder PO4) inkorporiert ist bzw. als andere mineralische Verbindungen vorkommen kann. Bei der Inkorporation in das Hydroxylapatit wird dessen Kristallgitter verändert (LeGeros 1981). Im Verlauf der Diagenese wird Karbonat in der Regel abgereichert. In anderen Fällen kann Karbonat jedoch auch aus nicht-biogenen Quellen angereichert werden (Elliott & Grime 1993, Newsely 1989; Krueger 1991). Insofern kann das Karbonat/Phosphat-Verhältnis nur eingeschränkt als Diageneseindikator gesehen werden.
Kristallform und -Dicke
Die Technik der Kleinwinkel-Röntgenbeugung (engl. small-angle X-ray scattering, SAXS) erlaubt die akkurate Bestimmung von Größe, Form und Orientierung von kristallinen Strukturen im Knochen und ist nicht abhängig von der Gefügehomogenität (Wachtel & Weiner, 1994; Fratzl et al. 1996a, 1996b). Dabei liefert SAXS komplementäre Informationen zu anderen Techniken wie der FTIR-Spektrometrie (Camacho et al., 1999, Wess et al., 2001, 2002, Hiller et al., 2003). Aus den gemessenen Werten lässt sich ein Formparameter ? berechnen (Fratzl et al. 1996a). Aus diesem Wert kann auf die Form der Kristalle geschlossen werden, d.h. ob sie als nadel-, platten- oder stäbchenförmige Strukturen vorliegen (Wess et al. 2001, 2002). Die Dicke von Knochenkristallen (T) wurde nach Fratzl et al. (1991; 1992; 1996a) berechnet. Aus Form und Dicke lassen sich Aussagen über den Erhaltungszustand des Minerals machen.
Der T-wert korreliert dabei eng mit dem Erhalt von Biomolekülen (Proteine, DNA) (Hiller 2003).
In der Studie von Burger et al. 2004 wurden diese Verfahren auf pleistozänes Faunenmaterial angewendet.
DNA-Degradierung
Zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung lagen bereits einige Arbeiten zur Biomolekül-Diagenese u. a. auch im Knochen vor (Hagelberg und Clegg 1991, Tuross 1994, Bada et al. 1994, Handt et al. 1994, Poinar et al. 1996, Handt et al. 1996, Höss et al. 1996). DNA-Degradierung bedeutet in erster Linie die Fragmentierung des DNA Strangs. Depurnierung destabilisiert das Phosphodiester-Rückgrat (Lindahl 1993) und führt somit zu Strangbrüchen. Desweiteren führen oxidative und hydrolytische Prozesse zur Bildung von Basen-Dimeren und zum Verlust bzw. zur Modifikation von Basen. Ein großer Teil dieser post mortem Schäden führt zur Nichtamplifikation des entsprechenden DNA-Abschnitts. Erst in letzter Zeit wurde auf Sequenzebene durch die Analyse klonierter aDNA-PCR Produkte die Bedeutung der Deaminierung von Cytosin zu Uracil erkannt, die letzendlich zu einer C zu T Transition führt.
Bei insgesamt 608 aDNA-Sequenzen einer anderen in Mainz durchgeführten Untersuchung (Burger et al. 2004) wurden 648 solcher post mortem Transitionen festgestellt. Davon gehörten lediglich 33 dem Typ I (nach Hansen et al. 2001 A zu G bzw. T zu C) und 651 dem Typ II (C zu T bzw. G zu A) an. Dass der vermutete oxidative Abbauweg von Cytosin über eine Deaminierung zu Uracil (Hofreiter et al. 2001) führt, wurde durch den Einsatz von Uracil-N-Glycosylase (UNG) nachgewiesen. Nach dem Einsatz des Enzyms UNG in das aDNA-Extrakt reduzierte sich die Zahl der Transitionen Typ II auf Null. Die Anzahl der Transitionen Typ I änderte sich dagegen nicht signifikant.
Während diese Art der Diagenese auf Sequenzniveau große Bedeutung für die Bestimmung mitochondrialer Haplotypen besitzt, sollte sie für die Fragmentlängeanalyse von short tandem repeats (STRs) eine untergeordnete Rolle spielen, da durch Deaminierungen allerhöchstens die Primerbindungsstellen affiziiert werden, aber keine unterschiedlichen Fragmentlängen entstehen können. Repetitive Polymorphismen unterliegen jedoch zusätzlich noch anderen Degradierungsmechanismen. Das Auftreten sogenannter Stotterbanden führt in der Regel zu einem um einen repeat verkürzten bisweilen auch um einen repeat verlängertem Amplikon. Bei stark degradierter DNA und sehr geringer Ausgangzahl von DNA-Matrizen kann es dazu kommen, dass ein um einen repeat verkürztes Molekül, das in den ersten Zyklen der PCR als Matrize dient, präferentiell weiter amplifiziert wird und somit zu einem Analyse-Artefakt führt.
Weitere Phänomene sind das sogenannte allelic dropout bzw. das locus dropout (s. Hummel und Schultes 2000, Balogh et al. 2003) Hierunter werden Phänomene zusammengefasst, die ebenfalls auf Grund geringer Molekülzahl zum Ausfall von Amplifikationsprodukten von nur einem oder sogar beiden Chromosomen führen.
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Joachim Burger