Isolation and culture of hepatocytes from the liver of the river lamprey Lampetra fluviatilis
K. R. MEWES, A. FISCHER, U. HOEGER, Institut für Zoologie der Universität Mainz, Saarstr. 21, 55099 Mainz
Die Leber ist als katabole und anabole Drehscheibe des Stoffwechsels für alle Vertebraten von herausragender Bedeutung. Da Untersuchungen an der Leber in vivo nur begrenzt möglich sind und einen hohen Tierverbrauch nach sich ziehen, gewinnt der Einsatz von Zellkulturen an Bedeutung. Ein entscheidender Durchbruch zur Isolierung von Hepatocyten gelang, indem die Leber mit proteolytischen Enzymen perfundiert wurde. Hierdurch werden im Organ Bindegewebe und Zell-Zell-Kontakte aufgelöst. Perfusionen mit Collagenase konnten bisher erfolgreich unter anderem an Ratten (Berry MN et al 1969: J Cell Biol 43, 506, Segeln PO 1976: Methods Biol 13,29) und an den Salmoniden Oncorhynchus mykiss (French CJ et al 1981: Eur J Biochem 113,311) und Oncorhynchus kisutch (Bhattacharya S et al 1985: Gen Comp Endocr 57, 103) durchgeführt werden. Die Isolierung von Hepatocyten aus Neunaugenlebern gelang bisher nur mechanisch mit geringer Ausbeute an intakten Zellen (Sonntag D 1984, Diplomarbeit). Um für eigene physiologische Experimente funktionsfähige und reproduzierbare Hepatocytenkulturen zu erhalten, testeten wir die aus der Literatur bekannten Perfusionsmethoden, die jedoch in keinem Fall zu einer befriedigenden Ausbeute führten. Auch die alleinige Verwendung anderer proteolytischer Enzyme (Nagarse, Bromelain, Pronase) zeigte nicht die gewünschte Wirkung. Erst eine Kombination aus Collagenase (109 Mandel-Units/ml) und Pronase (3,5 DMC-Units/ml) erwies sich als optimal zur Hepatocytengewinnung. Nach unserer Methode wird die Leber über die Vena hepatica perfundiert. Sobald die Leber weich geworden ist, wird sie über einem Gazefilter vorsichtig zerrieben. Die freien Zellen werden mehrmals mit Puffer gewaschen, bevor sie in Kulturmedium überführt werden. Die Zelldichte wird durch Auszählen in einer Zählkammer nach Neubauer bestimmt, der Anteil geschädigter Zellen im Trypanblau- Ausschlußtest ermittelt. Bis auf einen geringen Anteil roter und weißer Blutzellen besteht die Zellausbeute aus Hepatocyten (=Leberparenchymzellen). Die durchschnittliche Ausbeute beläuft sich bei weiblichen Tieren auf 3x108 Zellen (+/- 9,3x107), bei männlichen Tieren hingegen auf nur 7,4x107 Zellen (+/- 7,8x106), wobei die Leber durchschnittlich etwa 1g wiegt. Dieses Ergebnis deutet auf geschlechtsspezifische Unterschiede im Aufbau der Leber und in der Empfindlichkeit gegenüber den eingesetzten Enzymen hin. RPMI 1640- und Williams E- Medium erwiesen sich als geeignet , die Zellen über mehrere Wochen in einem morphologisch intakten Zustand zu kultivieren. Die Zellen werden in Kulturflaschen ausgesät, welche vorher mit Collagen beschichtet wurden. Nach spätestens 24 Stunden haben sich die Hepatocyten fest am Gefäßboden angeheftet. Frühestens nach 2 Tagen beginnen die Hepatocyten, sich abzuflachen und Lamellipodien auszubilden. Dieser Prozeß ist von zwei Faktoren abhängig: von der Art des Substrats und der Zelldichte in der Kultur. Lamellipodien werden nur auf einer Collagenmatrix, nicht aber in unbeschichteten Kulturgefäßen gebildet. Die Zelldichte beeinflußt die Flächenausdehnung der einzelnen Zellen. Steht den Hepatocyten genügend freie Fläche zur Verfügung, sind auch die Lamellipodien weiter ausgedehnt und stärker verzweigt als bei engem Kontakt zu benachbarten Zellen. Unsere Technik der Isolierung und Kultivierung von Hepatocyten ermöglicht es, den Lebermetabolismus von Neunaugen eingehender zu untersuchen. Uns interessieren hierbei die anabolen Leistungen der Leber im Hinblick auf die Geschlechtsreifung,vor allem die Synthese von Dotterproteinen für den Aufbau der Eizellen. Unter unseren Kulturbedingungen synthetisieren die Hepatocyten in der Tat Proteine. Durch die gute Zellausbeute können Zellen aus einer Leber für mehrere Experimente gleichzeitig verwendet werden. Dies wird den Tierverbrauch in Zukunft deutlich reduzieren und dient somit auch dem Artenschutz.
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Abt. 1