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Sonderforschungsbereich 490 - Projektbereich E

 

TP E2: Immunologische Kontrolle der latenten Cytomegalovirus-Infektion

Projektleiter: Dr. rer. nat. Natascha Grzimek-Koschewa, Prof. Dr. Matthias Reddehase

Die Cytomegaloviren (CMVs) überdauern lebenslang im spezifischen Wirtsorganisms trotz voll-entwickeltem, immunologischem Gedächtnis. Diesen Zustand, in dem kein infektiöses Virus gebildet wird, bezeichnet man als Latenz. Im vorliegenden Projekt konnte anhand des Modells der murinen CMV Infektion erstmals gezeigt werden, dass Latenz ein dynamischer Zustand ist, in dem virale Genexpression ständig stochastisch reaktiviert und von antiviralen CD8 T Zellen registriert und beendet wird. Ziele sind die Identifikation der latent-infizierten Zelltypen sowie die Aufklärung der molekularen Vorgänge bei Latenz-Etablierung und Virus-Reaktivierung.

Anhand des Modells der murinen Cytomegalovirus (mCMV) Infektion untersucht das Projekt die molekularen Mechanismen der Etablierung der Viruslatenz sowie die dynamische Immunüberwachung (Immune Surveillance) der Latenz durch CD8 T Zellen, die frühe Reaktivierungsereignisse anhand der Präsentation antigener viraler Peptide wahrnehmen und mittels ihrer Effektorfunktionen terminieren. Das Desilencing des Major Immediate Early (MIE) Locus durch lokale Öffnung der Chromatin-ähnlichen Struktur des viralen Episoms, und die damit verbundene Expression der regulatorisch wichtigen MIE Proteine, gilt als die molekulare Initiation der Virusreaktivierung. Nach der in diesem Projekt erstmals formulierten „Desilencing and Immune Sensing“ Hypothese erfordert die vollständige Reaktivierung des produktiven viralen Zyklus neben der Reaktivierung der viralen Genexpression auch ein Überwinden der Immunkontrolle an Kontrollpunkten (Immunological Checkpoints), deren Muster vom MHC Polymorphismus und vom viralen Proteom/Immunom bestimmt wird und somit für jedes Wirt-Virus Paar individuell ist. Durch gezielte Ausschaltung eines CD8 T Zell Epitops des MIE Proteins IE1 durch Punktmutation der C-terminalen MHC Anker-Aminosäure des IE1 Peptids gelang exemplarisch der grundsätzliche Nachweis eines immunologischen Kontrollpunktes. In logischer Fortsetzung dieser Arbeiten soll nun die Vorstellung der Existenz serieller, MHC Polymorphismus determinierter Kontrollpunkte bewiesen werden. Die Endothelzellen der Leber, die Liver Sinusoidal Endothelial Cells (LSECs) wurden als der zelluläre Ort der mCMV Latenz in der Leber identifiziert. Durch Zelltyp-spezifische konditionale Rekombination eines Reportervirus in LSECs der Tie2-Cre transgenen Maus, kombiniert mit der konditionalen Elimination replikativ-aktiver Diphtheria Toxin Rezeptor-exprimierender Reporterviren wollen wir die grundlegende Frage der Bedingungen für die Etablierung der Viruslatenz in Angriff nehmen. Wir versprechen uns von der Fortsetzung des Projektes weitere grundlegende Erkenntnisse zur Etablierung und Aufrechterhaltung der Latenz.

 

TP E3: Persistenz des murinen Cytomegalovirus nach Modulation des CD8 T-Zellimmunoms

Projektleiterin: PD Dr. rer. nat. et med. habil. Rafaela Holtappels-Geginat

Die Immunkontrolle der murinen Cytomegalovirus (mCMV)-Infektion erfolgt durch CD8 T-Zellen, die sich auf zwei dominante Epitope fokussieren. Erstaunlicherweise hat das Fehlen dieser beiden Spezifitäten keinen signifikanten Einfluss auf das protektive Potential mCMV-spezifischer CD8 T-Zellen. Wir konnten zeigen, dass die numerische Dominanz der beiden dominanten Spezifitäten auf einem hohen Anteil niedrig-avider CD8 T-Zellen beruht. Hohe Avidität ist jedoch wichtig für die Kontrolle der Infektion und diese korreliert nicht notwendigerweise mit der numerischen Dominanz einer T-Zellspezifität.

Die Kontrolle der mCMV-Infektion im Haplotyp H-2 d wird von den CD8 T-Zellspezifitäten IE1 und m164 dominiert. Es sollte geklärt werden, ob durch den Wegfall dieser Spezifitäten eine kontrollierbare Infektion in eine persistierende Infektion übergeht. Zur Bearbeitung dieser Fragestellung mussten zwei Voraussetzungen erfüllt sein: 1. die Möglichkeit einer gezielten Zerstörung der Epitope, ohne die Funktionalität der korrespondierenden Proteine zu verändern. Dies ist uns in Kooperation mit TP E2 gelungen. 2. die Möglichkeit, den Einfluss der Epitopmutationen auf die Verteilung mCMV-spezifischer CD8 T-Zellen präzise zu monitoren. Dazu wurde in Kooperation mit einer amerikanischen Gruppe ein ORF Library Screening etabliert, das die Antigenitätstestung jedes Open Reading Frame (ORF) von mCMV erlaubt. Dieser Ansatz ist in der Literatur bislang einzigartig.

Wir konnten zeigen, dass CD8 T-Zellen aus mit der Doppelepitopmutante infizierten Tieren die mCMV-Wildtyp (WT) Infektion nach Adoptivem Transfer genauso effizient kontrollieren, wie mCMV-WT geprimte CD8 T-Zellen. Die subdominanten Spezifitäten kontrollieren demnach die Infektion, was bemerkenswerterweise nicht durch den Wegfall der immunodomination durch die beiden dominanten Spezifitäten bedingt ist. Das Auslöschen der Epitope hat auf die Kontrolle der Infektion nach Knochenmarktransplantation (KMT) ebenfalls keinen Einfluss. Hier kommt es zu einer Adaptation des CD8 Immunoms durch Frequenzzunahme subdominanter Spezifitäten. Neue Spezifitäten tauchen nicht auf.

Wir konnten außerdem zeigen, dass die Dominanzhierarchie der CD8 T-Zellen von der eingesetzten Peptidkonzentration im Test abhängt: Bei hohen Konzentrationen subdominante Spezifitäten erwiesen sich bei niedrigen Konzentrationen überraschenderweise als dominant. Spezifitätshierarchien werden üblicherweise mit hohen Peptidkonzentrationen ermittelt. Damit kann jedoch nicht unterschieden werden, ob die reaktiven Effektorzellen hohe oder niedrige Avidität besitzen. Für das Verständnis der Kontrolle von Infektionen ist es von fundamentaler Bedeutung, den Zusammenhang zwischen Immundominanz und Avidität von CD8 T-Zellen hinsichtlich ihres protektiven Potentials besser zu verstehen. Dies möchten wir in der neuen Antragsperiode untersuchen.

Der neue Befund, dass sich die Spezifitätenverteilung in immunkompetenten Tieren von der in immunsupprimierten Tieren unterscheidet, macht die Bedeutung verschiedener Infektionsmodelle deutlich. In diesen Modellen möchten wir prüfen, wie die Infektion mit einer Quadrupel-Epitopmutante verläuft, in der neben IE1 und m164 zwei weitere - in der laufenden Förderperiode identifizierte - dominante Epitope aus den Proteinen M105 und m145 deletiert wurden. Erste Daten lassen den Schluss zu, dass die Quadrupelmutante im Vergleich zum mCMV-WT deutlich schlechter kontrolliert wird. Ob sich im KMT-Modell eine persistierende mCMV-Infektion entwickelt, möchten wir in der neuen Antragsperiode klären.

 

TP E4: Antigenpräsentation unter dem Einfluß der Immunevasine des murinen Cytomegalovirus

Projekleiter: Prof. Dr. Matthias Reddehase

Die Cytomegaloviren (CMVs) kodieren für virale Regulatoren der Antigenpräsentation (vRAPs), die im Nettoeffekt ihrer Wirkungen der Kontrolle durch das Immunsystem entgegenwirken. Im Modell der murinen CMV Infektion interferieren die drei Glykoproteine m04/gp34, m06/gp48 und m152/gp40 mit dem Transport Peptid-beladener MHC Klasse I Moleküle und inhibieren dadurch die Erkennung infizierter Zellen durch CD8 T Zellen. Ziele des Projektes sind die Aufklärung der Regulation der vRAP Genexpression, der Interaktion der vRAPs mit Adaptor-Proteinen intrazellulärer Transportwege, ihres Zusammenspiels, sowie ihrer Relevanz in vivo.

Die Antigenpräsentation im MHC Klasse-I Weg wird bei Cytomegaloviren (CMVs) durch spezielle viruskodierte Proteine, sogenannte „Viral Regulators of Antigen Presentation (vRAPs)“ inhibiert. Es ist auffällig, dass die vRAPs m04/gp34 und m06/gp48 des murinen CMV (mCMV) jeweils stabil an MHC Klasse I Moleküle binden, aber im Komplex mit diesen unterschiedliche Transportrichtungen einschlagen, nämlich zur Zelloberfläche oder zum Lysosom. Die strukturelle Basis für eine Beteiligung an den vesikulären Transportprozessen der Zelle liegt in den zytoplasmatischen Sequenzmotiven Yxx F (YRRF bei m04) und LL (ExxxxLL bei m06), die eine Interaktion mit den entsprechenden zellulären, heterotetrameren Adaptorproteinen AP-2/4 und AP-1A/3A nahelegen. Ausgangspunkt des Projektes war deshalb die Hypothese, dass m04 und m06 als virale Zwischenadaptoren dienen, welche die mit antigenem Peptid beladenen MHC Klasse I Moleküle an die entsprechenden Adaptorproteine strukturell ankoppeln. Ziel eines Programmteiles ist es, die Relevanz der AP-Bindemotive von m04 und m06 für den vesikulären Transport der MHC-Peptidkomplexe und damit für die Antigenpräsentation aufzuklären Ein zweiter Teil des Vorhabens basiert auf im bisherigen Projektverlauf gewonnenen neuen Erkenntnissen zur molekularen Identität des vRAPs m152, sowie der Regulation der Genexpression von m152. Es gibt Anhaltspunkte dafür, dass das m152 Glykoprotein in unterschiedlich hoch glykosylierten molekularen Spezies vorliegt und die immunevasive Wirkung, entgegen bisherigen Vorstellungen, nicht von gp40 wahrgenommen wird, sondern von einer höher glykosylierten Isoform. Desweiteren gehört m152 zu den wenigen Genen von mCMV, deren Promotorbereich ein Interferon-Stimulated-Response-Element (ISRE) besitzt. Dies führt uns zu der Hypothese, dass Typ I Interferone die Expression des Immunevasins m152 regulieren. Dies wäre ein völlig neuer Zusammenhang zwischen „Innate Defense“ und der adaptiven Immunantwort durch CD8 T Zellen. Wir versprechen uns von der Bearbeitung dieser Themen ein verbessertes Verständnis der Regulation und Modulation der protektiven antiviralen Immunantwort durch CD8 T Zellen.

TP E6: Molekulare Interaktionen bei der MHC-Klasse-I-restringierten Antigenprozessierung

Projektleiter: Dr. Stefan Tenzer, Prof. Dr. Hansjörg Schild

Dieses Projekt beschäftigt sich mit zwei Fragestellungen. Einerseits untersuchen wir die Rolle von t ransienten zytosolischen Aggregaten (Dendritic cell associated aggresome like induced structures – DALIS) als Substrate für die Herstellung von CTL Epitopen. Diese erlauben eine zeitliche Koordination der Präsentation von CTL Epitopen mit der Reifung dendritischer Zellen. Zum anderen untersuchen wir die Rolle von Aminopeptidasen bei der MHC-Klasse I restringierten Antigenpräsentation. Wir haben zwei neue mikrosomale Aminopeptidasen identifiziert und charakterisieren deren Funktion bei der Generierung von CTL-Epitopen.

 

TP E8: The role of antigen presenting cells in tolerance and pathogenicity of CD8 + T cells during viral and parasitic infection

Projektleiter: Prof. Dr. Ari Waisman

For an efficient immune response to viruses and parasites, involvement of both adaptive and innate cells is critical. The most important cells of the adaptive immune response are the CD8 T cells, but these cells need to be triggered first by antigen presenting cells (APC), in a process that involves also CD4 + T cells and cytokines produced by them. In the current grant proposal we will use different mutant mice to study the importance of different APCs in the CD8 T cells response, and how different sub-populations of CD4 + T control this response cells.

The way the immune response is initiated has a critical effect on its development, and on how the organism will be able to combat the pathogen. The adaptive immune system relies on dendritic cells (DCs) to activate CD4 + and CD8 + T cells that together should lead to an effective response that clears the invaders. Among the cells that are activated by the DCs, the CD8 + cytotoxic response has a critical role, as they are able to kill and clear the invading pathogens. In the last period of this collaborative research grant we have aimed to study the role of B cells in the immune response to two prototypic pathogens: Leishmania major and murine cytomegalovirus (MCMV). We were able to demonstrate the importance of B cells for an effective CD8 response in MCMV infection. Importantly, this contribution by B cells does not seem to require their secretion of antibodies, but rather their effector function, either as antigen presenting cells (APCs) or, possibly, by cytokine production. In a follow up experiment, we have used conditional gene targeting to delete the gene coding for IL-10, a cytokine that has previously been shown to control the immune system and suppress immune responses. Our preliminary results indicate that the B cell-produced, but not the DC-produced IL-10, indeed suppresses an effective CD8 response to MCMV. These findings will be extended in the next period of this grant and we plan to address the mechanism by which IL-10 suppresses the CD8 response. To extend our findings we will make use of our recently described system that allows for the ablation of DCs, either before or during MCMV infection. Preliminary experiments indicate that DCs have a critical role in the immediate response to MCMV, and in their absence a very poor CD8 response develops. We plan to better establish these findings, but also to investigate the later phase, namely the memory response to the virus. We will deplete DCs at later time points, and study whether this affects memory establishment, and whether DC ablation at later time points reduces the recall response.

Our studies on the role of B cells in Leishmania major infection yielded important findings. We could repeat earlier studies that show that antibodies are important for a good recognition of the parasite, but differences in the genetic background of BALB/c and C57BL/6 were detected. We were able to show that mice that lack antibodies but do have B cells develop smaller ear lesions compared to wild type mice. Interestingly, we found that these mice have a much higher parasite load in the spleen, indicating that antibodies are important in the control of the parasite spread in the body. In the next period of this grant we will be interested to continue and study these mice. In addition, we will extend our investigations also to the role of a specific population of CD4 T cells, namely the Th17 cells, in parasite clearance. Ample evidence links these cells, which can secrete IL-17A, IL-17F and IL-22 to effective clearance of pathogens. We will use a new reporter mouse line, which we have generated to follow these cells during inflammation. Further, we will use a second system that will allow us to ablate these cells and study their role in the response to the parasite. Finally, we will use another system that allows us to express the Th17-prototypic cytokine, IL-17A in T cells to study whether overexpression of this cytokine alone is sufficient for a better clearance of the parasite.

 

 

 

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Univ.-Prof. Dr. S. Bhakdi
Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
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